Totale Interne Reflexions Fluoreszenz (TIRF)

 

In den letzten Jahren ist der Bereich der Immunoanalytik sehr stark gewachsen. In der Arbeitsgruppe von Prof. Gauglitz wurde ein voll automatisiertes optisches Sensorsystem entwickelt, das basierend auf TIRF ("Total Internal Reflection Fluorescence") zum parallelen Nachweis verschiedener organischer Stoffe geeignet ist. Abbildung 1 zeigt den schematischen Aufbau des direkt optischen Immunosensors der sich aus einer Laserdiode, einem Transducer, einer Flusszelle, einem FIA-System kombiniert mit einem Probengeber, Polymerfaser, Filtern, Photodioden (PD), einem Lock-in Verstärker und einem Computer zusammensetzt.

Das Sensorsystem arbeitet mit fluorophormarkierten Antikörpern als biologisches Erkennungssystem für die Analyte. Proben können ohne Aufkonzentrieren und Probenvorbereitung vermessen werden.

Bei den als Bindungshemmtests durchgeführten Messungen können freie Bindungsstellen der Antikörper an die mit entsprechendem Analytderivat chemisch modifizierte Oberfläche des Glastransducers binden. An den Stellen der inneren Totalreflexion eines Laserstrahls im Wellen leitenden Transducer entsteht ein evaneszentes Feld. Die Fluorophore werden oberflächennah an diesen Spots zur Fluoreszenz angeregt. Das Fluoreszenzlicht wird mit Polymerfasern gesammelt und über Filter dem Detektionssystem zugeführt. Das Signal (effektives Signal) einer Messung ergibt sich dann aus der Differenz des maximalen Fluoreszenzsignals zum Untergrund, welcher durch die Basislinie gegeben ist.
Abbildung 3 zeigt beispielhaft die Entstehung eines Signals für niedrige und hohe Analytkonzentrationen.

Der beschriebene Immunosensor kann als schnelles, kosteneffektives und robustes Werkzeug z.B. im Bereich der klinischen Analytik, der Wasser- und Lebensmittelanalytik eingesetzt werden. Mit den verwendeten Transducern sind weit über 500 Messungen möglich. Die Oberfläche des Biosensors ist dabei vollständig regenerierbar und die Transducer zeigen eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Messergebnisse.
Der Sensor wurde bereits erfolgreich zur sensitiven Detektion (d.h. im unteren ng/L-Bereich) verschiedener Pestizide (z.B. Atrazin, Simazin, Isoproturon, Alachlor, 2,4-D, Propanil und PCP), natürlicher Hormone (z.B. Estron, Progesteron, Testosteron und Estradiol) und endokrin wirksamen Substanzen (z.B. Ethinylestradiol und Bisphenol A) eingesetzt. Hierbei kann die Analyse in verschiedenen Probenmatrices durchgeführt werden, z.B. Wasser, Milch, Blut oder Serum.

Anwendungen

Mit dem River Analyser (RIANA) wurde im Rahmen eines EU geförderten Projektes das erste Gerät entwickelt, das den auf TIRF basierenden Immunosensor einsetzt.

Die nächste Entwicklungsstufe wurde im EU-Projekt AWACSS (Automated Water Analyser Computer Supported System) umgesetzt.

Im Rahmen des PIWAS Projektes (Parallelisierbares Immunreaktionsbasiertes Wasser-Analysator-System) wurde ein drittes System aufgebaut, das den voll automatisierten Immunosensor verwendet.


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