MF-HTS Bericht

Aif-Forschungsvorhaben Nr. 13130:

MF-HTS

Markierungsfreies High Throughput Screening von Protein-Ligand Wechselwirkungen für die klinische Diagnostik und pharmazeutische Wirkstoffsuche

Gefördert aus Mitteln des Bundesministeriums für Wirtschaft und Arbeit über die Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschung, AiF:

Epitopmapping eines murinen Anti-Transglutaminase-Antikörpers und die Entwicklung von Nano-Kavitäten

Bernd Möhrle,Kerstin Kröger, Dieter Fröhlich, Jörg Bauer, Jörg Rademann,
Günther Jung und Günter Gauglitz

Ergebnisse:

1. Epitopmapping

Für die Zöliakiediagnostik existieren bislang Testsysteme, die auf bestimmten Gliadinpeptiden beruhen. Diese Peptide sind mit Ausnahme des von Mülbe beschriebenen Epitops [Mülbe_2001] nicht direkt spezifisch für Zöliakie. Weitere ELISA-Tests beruhen auf der Immobilisierung der vollständigen Transglutaminase, die jedoch teuer und aufwendig exprimiert werden muss.
Für das Epitopmapping wurde der Antikörper (CUB7402) aus der Maus für die Entwicklung des Testassays verwendet.
Der Antikörper erkennt 2 Regionen in dem Enzym Transglutaminase, bindet jedoch mit höherer Affinität an das lineare Epitop, das vom Proteinsegment mit den Aminosäuren 441-475 gebildet wird. Dieser Proteinsegment wurde mittels 21 überlappende N-Cysteinyl-Peptide mit der Fmoc/tert-butyl-Strategie durch parallele Peptidsynthese auf mit 2-Chlortritylchlorid funktionalisierten Polystyrol-Harzen nach Jung [Jung_1996, Jung_1999] dargestellt.
Von Peptid Nr. 6 war bekannt, dass es eine gute Bindung zum Antikörper aufwies. Dieses Peptid Nr. 6 (Sequenz Abbildung 1) wurde auf der gesamten Oberfläche des Glastransducers für die parallele RIfS-Messung immobilisiert.

Abbildung 1: Synthetisierte Peptidsequenzen der Transglutaminase des Proteinsegmentes von 441 bis 475 für das Epitopmapping [Kröger_2002]


Es folgte ein Bindungshemmtest aller 21 Peptide gegenüber dem Antikörper CUB7402. Die Bindungsinhibition wurde für alle Peptide gleichzeitig und ohne Markierung des Antikörpers im parallelisierten RIfS gemessen (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2: Prototypischer Aufbau eines parallelisierten Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS) Messplatzes; Demonstrator 0



Abbildung 3: Screeningergebnisse für das Epitopmapping, links erste Messung und Belegung, rechts zweite Messung. Z1-Z8 entsprechen den Zeilen und S1-S6 entsprechen den Spalten des Probenarrays. Die Zahlen 1-21 geben die Nummern der eingesetzten Peptide an, 0 entspricht reinem Puffer und Antikörper reiner Antikörperlösung

Die einzelnen Ergebnisse der Messungen sind in der Abbildung 3 mit den entsprechenden Tabellen zur Chip-Belegungen gezeigt. Diese Abbildung soll verdeutlichen, dass die Proben über den gesamten Chip statistisch verteilt waren und die Bindungsstärke nicht vom Ort auf dem Chip abhängig war. Die Ergebnisse dieser Messung sind in Abbildung 4 zusammengefasst.

Abbildung 4: Zusammenfassung der Screeningergebnisse des Epitopmappings: Als posi-tive Referenz wurde 5 µg/ml Antikörperlösung als negative Referenz PBS eingesetzt. 1-21 sind die Nummern der Peptide in den jeweiligen Lösungen (vergleiche Abbildung 2).

Für den ersten Bindungshemmtest wurde eine hohe Konzentration der Peptide von 20 µg/ml gewählt. Damit ließen sich zunächst alle Peptide erfassen, die eine mindestens mittlere Affinität zum Antikörper aufweisen. Eine Referenzmessung mit 5 µg/ml Antikörper ergab ein Signal von 1.2 nm. Nur mit Puffer (PBS in Abbildung 4) wurde keine Bindung detektiert. In Messungen mit geringer oder keiner Signaländerung wurden den Antikörperlösungen Peptide zugesetzt, die eine Affinität zum Antikörper aufweisen. Dies waren die Peptide Nr. 6-11.
Um aus den Peptiden mit Affinität zum Antikörper das Peptid mit der höchsten Affinität zu bestimmen, wurde mit den Peptiden Nr. 5-12 der Bindungshemmtest mit kleinerer Konzentration der inhibierenden Peptide wiederholt. Die Wahl der kleineren Peptid-Konzentration von 15 µg/ml ermöglichte eine bessere Unterscheidung der unterschiedlich affinen Peptide.
In Abbildung 5 sind die Originalmesskurven aus Dreifachmessungen dargestellt. Die unterschiedlichen Affinitäten der Peptide resultieren in unterschiedlichen Änderungen der optischen Schichtdicken.

Abbildung 5: Originalkurven der Dreifachmessung des zweiten Screenings

Peptid Nr. 8 konnte bei diesem Bindungshemmtest als das Peptid mit der höchsten Affinität identifiziert werden, gefolgt von den Peptiden Nr. 7, 9, 6 und 10. Die Peptide 11, 12 und 5 zeigen eine geringe Inhibierung.
Mit dem parallelen RIfS-Aufbau lassen sich keine Affinitätskonstanten bestimmen, da hierzu Messungen im Flusssystem mit gleich bleibender Diffusion nach dem ersten Fickschen Gesetz notwendig sind. Um die genauen Affinitätskonstanten der Peptide zu bestimmen, wurde daher ein Bindunghemmtest nach Piehler [Piehler_1997] im Einkanal-RIfS-System hinzugezogen. Die Ergebnisse der Affinitätsbestimmung von einigen Peptiden, durchgeführt mit einer Antikörperkonzentration von 600 ng/ml, sind in Abbildung 6 gezeigt.

Abbildung 6: Bindungshemmtest mit Peptiden No 6, 7, 8, 11, 16, 21

Es konnten von den Peptiden Nr. 8, 7, und 6 die Affinitätskonstanten mit
(2.0 0.6)*10^8 M-1 ,
(1.8 0.7)*10^8 M-1 und
(1.7 0.5)*10^8 M-1 bestimmt werden.
Von den Peptiden Nr. 11, 16 und 21 konnten keine Affinitätskonstanten bestimmt werden. Peptid Nr. 11 zeigt eine geringe Inhibierung, jedoch konnte auf Grund der Aggregation der Peptide auf der Oberfläche ab einer Konzentration von 50 µg/ml keine höhere Peptidkonzentration zur möglichen Bestimmung der Affinität eingesetzt werden.
Mit der parallelen RIfS ist bei einer entsprechenden Affinität eine exakte Unterscheidung von Peptiden auch bei der Verschiebung von nur einer Aminosäure möglich. Damit konnte das Proteinsegment der Transglutaminase vollständig erfasst und das Peptid Nr. 8 mit der höchsten Affinität sehr genau bestimmt werden. Da das für den diagnostischen Assay gesuchte Peptid später auf der Oberfläche immobilisiert werden sollte, trugen alle hier untersuchten Peptidsequenzen ein endständiges Cystein. Eine Änderung der Affinität durch den Einfluss des für die Immobilisierung notwendigen Cysteins kann somit minimiert werden.
In Abbildung 4 ist ein starker Abfall des Signals von Peptid Nr. 5 zu 6 und zwischen Nr. 12 und 11 zu erkennen. Bei Betrachtung der Peptidsequenz wird offensichtlich, dass polare Seitengruppen der Aminosäuren Asparagin und Glutaminsäure großen Einfluss auf die Affinität haben, der mit der Bildung von Wasserstoffbrücken der polaren Seitengruppen mit dem Protein erklärt werden kann.
Der Antikörper bindet mit einer Affinität von 2.0*108 M-1 an das Peptid Nr. 8, welches das Peptid mit der höchsten Affinität zum Antikörper ist [Kröger_2002].
Die Ergebnisse des parallelen RIfS-Systems stimmen mit den Messungen im Einkanalsystem überein. Dies zeigt zum einen die Konsistenz der Daten, aber auch die Genauigkeit des parallelen RIfS-Systems.
Damit kann das parallele RIfS konventionelle Methoden, wie z.B. den ELISA ersetzen. Zusätzlich ist mit RIfS eine schnellere Bestimmung des passenden Peptids und eine einfache und schnelle Übertragung auf das Einkanalsystem zur genauen Bestimmung der Affinitätskonstante gegeben.

 

2. Messung von Antikörpern im Blutserum mit dem parallelen RIfS-System

2.1 Voruntersuchungen zur Messung in Blutseren von Patienten

Als Voruntersuchung für die Messung in Patientenserum, wurde zur Erfassung aller gegen Transglutaminase gerichteten Antikörper das Enyzm selbst kovalent an die Oberfläche gebunden.
Es wurden sieben verschiedene Blutseren aus Patienten der Kinderklinik Oslo getestet. Die Ergebnisse der Messung sind in Abbildung 7 gezeigt. Für einen besseren Vergleich erfolgten alle Messungen auf einem Chip. Es konnten deswegen nur Zweifachmessungen durchgeführt werden, allerdings für die einzelne Blutprobe in den Verdünnungen von 1:5 und 1:10, so dass quasi Vierfachmessungen vorliegen. Nach der eigentlichen Messung wurde eine Referenzmessung mit dem monoklonalen Anti-Transglutaminase-Antikörper vorgenommen. Die Blutseren wurden gegen diese referenziert und die Messung der negativen Probe subtrahiert.

Abbildung 7: Ergebnis der RIfS-Testung von 7 Patientenseren

Die Messung von reinem monoklonalen Anti-Transglutaminase-Antikörper als Referenz in der Konzentration von 5 µg/ml ergab eine Änderung der optischen Schichtdicke von 500 pm. Die Patientenseren stammten von Patienten, welche auf Zöliakie mittels Biopsie getestet wurden. Die Seren mit der Benennung DOG und EJ waren negativ, alle anderen waren positiv auf Zöliakie getestet. Mit RIfS konnte dies nachvollzogen werden. Die positiven Seren konnte alle identifiziert werden. Dies zeigt, dass mit entsprechender Referenzierung Diagnostik von Patientenseren in Blut mit RIfS möglich ist.

2.2 Messung der Blutseren auf peptidfunktionalisierten Oberflächen

Zur Detektion von Antikörpern gegen die Transglutaminase in Blutseren von Zöliakie-patienten konnten die Peptide des Epitopmappings nicht verwendet werden, da es sich dabei um das Epitops eines Antikörpers aus der Maus handelte.
Zur Detektion von humanen Antikörpern wurde auf ein bereits bekanntes Peptid, das gegen Antikörper von Zöliakie-Patienten Spezifität aufweist, aus der Arbeitsgruppe Jung zurückgegriffen [Mülbe_2001].
Dort wurde ein Epitop aus dem ?-Gliadin(85-100) mit der Sequenz LPFPQQPQQPFPQPQQ und einer Molmasse von 1903.9 als Substrat für die handelsübliche Meerschweinchen-Gewebs-Transglutaminase (gp-tTGase) identifiziert.
Es konnte eine gezielte enzymaktivierte Deamidierung durch gp-tTGase des Glutamins an Position 5 im Peptid LPFPQQPQQPFPQPQQ zum Peptid LPFPEQPQQPFPQPQQ ermittelt werden[Molberg_1998]..
Das Peptid mit der Sequenz H-C-Aca-LPFPEQPQQPFPQPQQ-OH wurde deshalb auf die Oberfläche immobilisiert. Es wurde wegen der beträchtlichen unspezifischen Bindung von Blutserum auf der Transduceroberfläche ein Sandwich-Assay mit 2 Waschschritten gewählt.

Testformat:
1. 1:10 Verdünnung Blutserum in Tris/HCl-Puffer pH 7,0
2. Waschschritt 1: 1ml deionisiertes Wasser
3. Waschschritt 2: 1ml 1mol/l NaCl-Lösung in Tris/HCl-Puffer pH 7,0
4. Anti-IgA-Antikörper 5µg/ml.

Da das Immunsystem in der Mehrzahl IgA Antikörper gegen die Transglutaminase bildet, konnte mit dem Anti-IgA-Antikörper die spezifische Bindung der körpereigenen Transglutaminase-Antikörper verifiziert werden.
In Abbildung 8 sind exemplarisch die Rohdaten der Blutseren KMM, positiv, und DOG, negativ, gezeigt.

Abbildung 8: Messung der Patientenseren im Sandwich-Format

Alle Blutseren wurden auf einem Sensorschip gemessen. Die Transduceroberfläche konnte ohne Probleme regeneriert werden.
Zur Auswertung wurde die Bindung des Anti-IgA-Antikörpers herangezogen.
Die Auswertung der 7 Patientenseren sind in Abbildung 9 gezeigt.

Abbildung 9: Änderung der optischen Schichtdicke bei Bindung der Anti-IgA-Antikörper an den Autoimmunantikörper aus dem Blutserum

Die Blutserumproben KMM, HL, und GII konnten eindeutig als positiv detektiert werden. Die Blutserumproben EF und KOL dagegen nicht. Beide Proben befinden sich im gleichen Bereich wie die Negativkontrollen DOG und EJ. Da das Immunsystem Antikörper gegen verschiedene Epitope der Transglutaminase bildet, ist es nicht weiter verwunderlich, daß nur drei der fünf positiven Blutserumproben als positiv identifiziert werden konnten. Mit der Umstellung auf ein Array-Format mit mehreren Peptiden, die Antikörper gegen die Transglutaminase erkennen, könnte man die Diagnosestellung sicherlich verbessern und die Kosten gegenüber herkömmlichen ELISA-Tests, die das teure aufgereinigte Enzym verwenden, senken.
Mit RIfS kann man also direkt aus dem Blutserum Antikörper gegen die Transglutaminase detektieren.

3. Entwicklung von Nano-Kavitäten

Um die Probenmenge weiter zu reduzieren wurden Nano-Kavitäten aus Polystyrol entwickelt.
Die Strukturierung dieser selbstklebenden Polystyrol-Plättchen (Dicke von 500 m) wurde mit einem blitzlampengepumpten Nd-YAG Laser durch Laserablation erreicht. Die Strahlung wird mit Hilfe einer langbrennweitigen Linse auf das zu strukturierende Plättchen fokusiert. Jeder Blitz des Lasers führt im Fokuspunkt zu einer Energiedichte, die die schlagartige Verdampfung von Oberflächenschichten des Polystyrols und des Klebers zur Folge hat. Etwa 100 Blitze bei 10 Hz waren bei der gewählten Entladespannung der Blitzlampen nötig, um das Plättchen zu durchdringen. Anschließend wurde von dem Loch mit einem Durchmesser von ca. 100 m ausgehend, in einer Spiralbahn die Kavität mit dem gewünschten Durchmesser erzeugt.

Abbildung 10: Abbildungen der Lochstruktur aufgenommen mit einem Mikroskop, Spotmitte zu Spotmitte: 500 µm.

Abbildung 11: Profil der Kavitäten auf dem Glastransducer aufgenommen mit dem Oberflächenprofilometer. Es konnte keine exakte Höhe bestimmt werden.

Bis zu 96 Kavitäten mit einem Durchmesser von jeweils 350 m in einem 4x24 Array wurden so mit Hilfe eines Programms und eines computersteuerbaren XY-Tisches vollautomatisch gebrannt (Abbildung 10). Die langbrennweitige Linse führt zu steilen Kavitätenwänden, was die Herstellung einer optimal großen Wechselwirkungsfläche für die Messung erlaubt. Nicht nur die optische Inspektion mit dem Mikroskop zeigte die Steilheit der Wände, auch die Messung mit einem Oberflächenprofilometer bestätigte es (Abbildung 11).


TopSpot-Düsenplatte mit 4x24 Reservoirs und Düsenarray in der Mitte

Momentaufnahme von der parallelen
Abgabe der Tropfen

Abbildung 12

Der Düsenabstand beim TopSpot-Gerät (Abbildung 12) beträgt 500 m. Die Polystyrol-Kavitäten auf dem Glastransducer wurden auf weniger als 50 m genau unter den Düsenöffnungen platziert. Die Abbildung 13 zeigt das Fluoreszenzbild eines 4x6 Arrays, bei dem jede zweite Kavität im Schachbrettmuster mit einer Fluoreszenzfarbstofflösung gefüllt wurde.

Abbildung 13: mikrodosierter Fluoreszenzfarbstoff in Nanokavitäten

Der Inhalt einer 300x300x500 m3 Kavität beträgt weniger als 50 nl. Ohne Vorkehrungen würde er bei Raumtemperatur in einer Minute verdunsten. Für eine brauchbare Messung der molekularen Wechselwirkungen sollte der Kavitäteninhalt innerhalb der Messzeit nicht nennenswert abnehmen. Um die Verdunstung zu minimieren wurden die Düsenplatte und der Messtisch gekühlt.

Abbildung 14: Beispiele für aufgeklebte Kavitäten mit verschiedenem Raster
Zur Detektion wurde ein weiterentwickeltes RIfS-System, das Mikro-RIfS, verwendet.

Das Mikro-RIfS ist eine konsequente Weiterentwicklung des parallelen RIfS-Verfahrens hin zu Miniaturisierung. Das optische Prinzip entspricht weitgehend dem, wie es im Demonstrator 0 realisiert ist, jedoch wird beim Probenhandling der Schritt von der Mikrotiterplatte zu Nano-Kavitäten vollzogen.

Abbildung 15: Optischer Laboraufbau des miniaturisierten parallelen RIfS

Die ausgeleuchtete Fläche des Transducers beträgt 12x18 mm2. Das Licht wird unter 45o eingestrahlt und reflektiert. Der Wellenlängenbereich, der mit den Filtern abgedeckt wird, reicht von 620 nm bis 852 nm. Ein Messzyklus für die Aufnahme eines Spektrums aus 7 Meßpunkten wird auf Grund der Geschwindigkeit des Filterrades in 17,7 Sekunden bewältigt (Abbildung 15).

Abbildung16: Bindungsreaktion eines Antikörpers an immobilisiertes Antigen

Es wurde die Bindungsreaktion eines Antikörpers gegen Pestizide an ein auf der Oberfläche immobilisiertes Antigen in Kavitäten mit 850 m Durchmesser gemessen. Der gegenseitige Abstand der Kavitäten beträgt 1 mm, so dass 100 Kavitäten/cm2 hergestellt und parallel vermessen werden können.
Die relative Signaländerung liegt deutlich über dem Rauschen. Da es sich bei dem Transducer um ein Schichtsystem gehandelt hat, das nicht für 45 Grad Einstrahlung und Reflektion optimiert war, ist zu erwarten, dass bei anderem Schichtaufbau ein noch besseres Signal/Rausch-Verhältnis erreichbar ist.

4. Zusammenfassung

Die Verwendung der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS) konnte sich als Detektionsprinzip im Screeningbereich bewähren.

Mit einer zielgerichteten Peptidsynthese konnten durch die Einführung eines Cysteins die Peptide mit der entsprechenden Oberflächenchemie über den Bernsteinsäure-Aktivester der 3-N-Maleimido-Capronsäure orientiert auf der Oberfläche immobilisiert werden. Die synthetisierten Peptide und deren Aufreinigung mit HPLC auf über 95% Reinheit ermöglichte die genaue Definition eines Linearepitops der Transglutaminase. Mit einer geeigneten Oberflächenchemie konnten unspezifische Wechselwirkungen auf ein Minimum reduziert werden.

Mit Hilfe der optischen Detektion der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie konnte eine Epitopkartierung im HTS-Format (High Throughput Screening) in kürzester Zeit durchgeführt werden. Die Antikörper mussten dabei nicht markiert werden und die Bindung auf der Transduceroberfläche konnte in Echtzeit verfolgt werden. Die nicht notwendige Markierung der Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen führt zu einer Kostenreduktion und die zeitaufgelöste Detektion des Bindungsereignisses zu einer Zeitersparnis im Screening von pharmazeutisch relevanten Substanzen.
Durch einen Wechsel der Testformate, vom Stop-Flow-System in der 96-well Platte zum Fließinjektionssystem am Einzelplatz, konnten die exakten Affinitätskonstanten des Antikörpers zu den aussichtsreichsten Peptiden bestimmt werden. Mit dieser sonst nicht zugänglichen Information kann die molekulare Wechselwirkung des Antikörpers zu seinem Epitop vollständig charakterisiert werden. Dies ermöglicht die genaue Beschreibung des Epitops.

Die Untersuchungen von Patientenseren mit der immobilisierten Transglutaminase und mit einem dominanten Peptid auf der Transduceroberfläche zeigen die Übertragbarkeit von RIfS in den Bereich der klinischen Diagnostik. Blutserum zählt zu den komplexesten Matrices im Bereich der Detektion auf planaren optischen Transducern. Trotzdem konnten, durch die Verwendung einer ausgereiften Oberflächenchemie, die Autoimmunantikörper gegen die Transglutaminase im Blutserum von Zöliakie-Patienten markierungsfrei detektiert werden.

Im Bereich der Miniaturisierung und Parallelisierung wurden neue Wege bestritten. Mit den erzeugten Nano-Kavitäten können Probenvolumen von unter 50nl verwendet werden. Die Apparatur beinhaltet eine Kühlung, gegen Verdunstung der Proben, und mit dem Top-Spot ein geeignetes Befüllungssystem. Es wurde gezeigt, dass mit dem miniaturisierten RIfS-System grundsätzlich diese Kavitäten optisch in Echtzeit ausgelesen werden können.


Die Forschungsstellen, Universität Tübingen, Institut für Physikalische und Theoretische Chemie und Institut für Organische Chemie, danken dem Bundesministeriums für Wirtschaft und Arbeit, und der Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschung, AiF, für die Förderung dieses Forschungsvorhabens.

Weitere Informationen erhalten Sie bei den Forschungsstellen.

5. Literatur

Jung G. (Hrsg.) (1996) Peptide and Nonpeptide Libraries
Wiley-VCH, Weinheim.

Jung G. (Hrsg.) (1999) Combinatorial Chemistry
Wiley-VCH, Weinheim.

Kröger K., Bauer J., Mülbe F.v.d., Fleckenstein B., Rademann J., Jung G., Gauglitz G. (2002) Epitope-mapping of Transglutaminase with Parallel Label-free Optical Detection
Biosens. Bioelectron. 17, 937-944.
System. Tissue Antigens 55 (6), 571-2.

Molberg O., Mcadam S.N., Korner R., Quarsten H., Kristiansen C.,. Madsen L, Fugger L., Scott H., Noren O., Roepstorff P., Lundin K.E.A., Sjostrom H., Sollid L.M. (1998) Tissue transglutaminase selectively modifies gliadin peptides that are recognized by gut-derived T cells in celiac disease
Nat. Med. 4, 713–717.

Mülbe F.v.d. (2001) Einfluss der Gewebstransglutaminase auf die Pathogenese der Autoimmunerkrankung Zöliakie
Dissertation Universität Tübingen.

Piehler J., Brecht A., Giersch T., Hock B., Gauglitz G. (1997) Assessment of affinity constants by rapid solid phase detection of equilibrium binding in a flow system J. Immunol. Meth. 201, 189-206.